O tym co ja właściwie robię na VUB

W sumie nie sądzę, że kogokolwiek to obchodzi, ale na wszelki wypadek, gdyby jednak tak, napiszę  kilka słów o tym jak się bawię w tej pracy. 

Czasy kiedy dostawałam udko z myszy do obrazowania biegnącej tam tętniczki już minęły. Tu, w Belgii mikroskopii używają głównie do pyknięcia jednego czy dwóch obrazków raz a jakiś czas, ale w ani jednym labie nie gra ona pierwszych skrzypiec. To z resztą mocno utrudniło mi znalezienie fajnej pracy. W końcu trafiłam w miejsce, gdzie pół na pół wykorzystywane są rzeczy, które już umiem zrobić i uczę się nowych.  

To, co obrazowałam w czasie doktoratu, czyli spajającą komórki i nadającą tkankom wytrzymałość macierz zewnątrzkomórkową, teraz niszczę już na pierwszym etapie eksperymentu, bo interesują mnie tylko i wyłącznie  komórki. W szczególności -  komórki układu odpornościowego. Luzem. Każda osobno, za to tak ze 400.000 na próbkę, 5.600.000 na eksperyment, żeby dostać jakiś istotny statystycznie wynik. Oczywiście nie oglądam pojedynczo każdej z tych komórek. Rzuca na nie swoim fotopowielaczowym okiem  sprzęt, a ja analizuję tylko rozkład kropek na wykresie. 

Ów sprzęt, to cytometr przepływowy. Sprytna maszynka, która zasysa komórki z fiolki, rozcieńcza i przepuszcza jedną za drugą przez wiązki laserów, które wzbudzają fluorescencję i detektorów, które ją rejestrują. W naszym labie są dwa cytometry: stary Canto, który pozwala na obserwację do 8 znaczników fluorescencyjnych na raz, i nowy - Symphony, na którym da się obserwować nawet 27 różnych fluoroforów. 

Przejdźmy zatem do... No nie, nie będzie szczegółów, ale napiszę przynajmniej po co mi ten cytometr i jak się to robi. 

Komórek odpornościowych jest wiele rodzajów. Większość z nich można znaleźć we krwi i limfie. Ale moje zainteresowanie ogranicza się do tych, które zasiedlają nowotwór, stanowiąc jego tak zwane mikrośrodowisko. Wiemy już, że układ odpornościowy nie do końca radzi sobie z nowotworami, ale jeszcze nie do końca wiemy co zrobić, by radził sobie lepiej (choć mamy na tym polu niewątpliwe sukcesy). 

Guz stanowi dla układu odpornościowego ogromne wyzwanie. Jego komórki są inne, niż te zdrowe, ale jednak własne, a układ odpornościowy ma ignorować własne, a niszczyć obce. Mało tego, komórki w guzie mutują, zmieniają się i wciąż próbują przechytrzyć układ odpornościowy. Wiele z nich w tej zabawie w kotka i myszkę trafi złą strategię przetrwania i ginie ale niektóre nie tylko są w stanie przetrwać ale nawet "ogłupić" układ odpornościowy tak, że ten zaczyna im pomagać. I właśnie te pomagające układowi odpornościowemu komórki są u mnie na celowniku. Z innych badań, wiemy, że produkują w dużych ilościach konkretną cząsteczkę, cytokinę, która pełni rolę sygnalizacyjną. To taki chemicznym nośniki informacji dla innych komórek by COŚ zrobić. Nie wiemy jednak gdzie ten sygnał jest odbierany ani co robi. To właśnie próbuję odkryć.

Zatem do roboty! Żeby wyizolować coś z guza, muszę mieć guz. W tym celu wykorzystujemy mszy. Jest to najgorsza część pracy. Mimo że guzy, które myszom inokulujemy (wstrzykując im komórki nowotworowe) w większości nie dają przerzutów i poza swoją obecnością aż do pobrania nie są raczej wybitnie uciążliwe i nie powodują bólu, to jednak nie jest to przyjemna część pracy. 

Izolacja guza nie jest skomplikowana. Guzy rosną pod skórą na boku, lub w gruczole sutkowym myszy, doskonale widoczne gołym okiem. Za to później robi się zabawnie. Guz wyglądający jak kawałek brzydkiego mięsa trzeba pociąć. W tym celu używamy... nożyczek. Guz w szalce z niewielką ilością pożywki tniemy na maciupkie kawałeczki. 

Następnie dodajemy mieszaniny enzymów i czekamy 25 min aż owe enzymy strawią włókna na zewnątrz komórek. Następnie miażdżymy te małe kawałeczki tłoczkiem do strzykawki. (Akurat ma fajny rozmiar i jest zapakowany sterylnie, więc idealnie się nadaje. (To z serii "niekonwencjonalne zastosowanie sprzętów".) Po zmiażdżeniu przelewamy to, co zostało przez pipetę czyli  przez wąski otwór, pod sporym ciśnieniem) kilka razy tam i z powrotem, by dokładnie rozdzielić komórki, a później filtrujemy przez pocięty i wyjałowiony filtr do Ferrari 😆 (Ma odpowiednią charakterystykę, pory o średnicy 70 mikrometrów i jest znacznie tańczy niż filtry dedykowane do tego zastosowania) do falkonów. 

Taką zawiesinę właściwie już pojedynczych komórek wirujemy, zlewamy płyn z góry, dodajemy buforu, w którym niszczą się czerwone krwinki, które znów przeszkadzałyby w analizie, ponownie filtrujemy i przechodzimy do kolejnej części naszej zabawy.

 

To białe na dole to właśnie pojedyncze komórki z guza. Są to zarówno komórki nowotworowe jak i komórki naczyń krwionośnych, a zatem nabłonek, mięśnie, komórki tkanki łacznej jak i komórki odpornościowe. To już nie śmierdzi mięchem i jest jakieś takie bardziej "sterylne". 

Pojedyncze komórki trzeba przygotować do analizy. W końcu w mieszaninie jest wszystko, a ja chcę wiedzieć ile i jakich komórek się tam znajduje. 

Ewolucja przebiegała na tyle dla nas łaskawie, że wyposażyła komórki układu odpornościowego w swego rodzaju "legitymacje pracownicze" na powierzchni, dzięki czemu te pozwalają dość łatwo się zidentyfikować. Każda komórka układu odpornościowego ma na  powierzchni swojej błony markery zwane klastrami różnicowania (CD), które można rozpoznać i wyznakować odpowiednimi przeciwciałami zawierającymi cząsteczkę fluoryzującą w jakimś kolorze. A my te klastry różnicowania całkiem nieźle znamy. 

I tak wszystkie komórki układu odpornościowego mają na powierzchni białko oznaczane przez nas CD45. Załóżmy, że do mieszaniny komórek w probówce dodamy przeciwciało rozpoznające CD45 znakowane barwnikiem PE, które się do niego zwiąże. I już na podstawie tego, czy komórka jest wyznakowana PE czy nie, możemy odsiać wszystkie komórki nowotworowe, komórki naczyń krwionośnych i całą resztę, a do analizy zostawić to, co jest interesujące. Na podstawie obecności lub nie- innego barwika odrzucamy komórki martwe, gdyż z nimi mogło podziać się coś dziwnego i może coś być w ogóle nie tak. Do analizy bierzemy tylko komórki żywe. 
Oczywiście takich znakowanych przeciwciał wiążącym przeróżne markery dla różnych węższych grup komórek dodajemy cały koktajl. Ja mam pewnie ze 20. I każde z nich w jakiś sposób ułatwia mi tę szczegółową analizę, pozwalając już naprawdę precyzyjnie określić z czym mamy do czynienia. I tak mogę na przykład powiedzieć ile mam w mieszaninie monocytów ile makrofagów, ile komórek T i jakiego rodzaju i tak dalej. A ilości poszczególnych rodzajów komórek  mogą zmieniać się w zależności od wielu czynników oraz oznaczają już konkretne zmiany rozkładu sił i podejmowanych przez układ immunologiczny działań w guzie. Ja porównuję liczby poszczególnych rodzajów komórek w guzie u zwykłych myszy i u myszy zmodyfikowanych genetycznie, tak, że nie produkują interesującej nas cytokiny. Takie porównanie powinno powiedzieć nam czy obecność owej cytokiny w jakiś sposób wpływa na liczbę poszczególnych komórek układu odpornościowego w guzie. Może tych, które hamują odpowiedź immunologiczną i ochraniają komórki guza? A może tych, których zadaniem jest jego niszczenie? (Ja już wiem, ale nie powiem, najpierw muszę opublikować wyniki. 😉)

Wybarwione moim koktajlem przeciwciał komórki umieszczam w cytometrze. Jeśli dana komórka zawiera przeciwciało z odpowiednim znacznikiem, to wyemituje sygnał fluorescencyjny (o intensywności proporcjonalnej do liczby związanych przeciwciał), który następnie jest wyłapywany przez detektor. .

Przeliczony sygnał pojawia się na monitorze w postaci kropki na odpowiednio wybranych skalach. Zmieniając ustawienia (pod kątem analizowanych znaczników fluorescencyjnych) można sprawdzić jak dużo jakich komórek jest w danej próbce. 

A tak wyglądają moje dane. Są tu dwie osie, każda dla jednego barwnika. Każdej komórce odpowiada jeden punkt. czym wyżej na wykresie się znajduje, tym silniejszy emituje sygnał dla barwnika 1. Cym dalej w prawo- tym silniejszy emituje sygnał dla barwika 2. I tak mogę powiedzieć, że komórki na dole i po lewej stronie wykresu nie zawierają markerów, które wyznakowałam, po lewej na górze zawierają marker 1, ale nie marker 2, na dole po prawej zawierają marker 2, ale nie marker 1, a po prawej na górze - zawierają oba markery. 

I to już wszystko. Szczegółowa analiza wymaga wyselekcjonowania poszczególnych pul komórek, a z nich, zmieniając układ barwników na osiach kolejnych i kolejnych, aż dochodzę do zawartości na przykład makrofagów zwalczających nowotwór  tych pomagających mu, w ogólnej puli makrofagów. 

Tu czym wyżej na osi y, tym więcej związanego barwnika dla komórek układu immunologicznego. "Bramka" ustawiona na komórki układu immunologicznego, CD45+. Tylko one będą analizowane dalej. Na osi x jest tylko wielkość komórek. Czyli czym dalej w prawo, tym większe. To dodatkowa cecha, którą rejestruje cytometr. 

Chyba najtrudniej w tym wszystkim jest zapamiętać na co który marker, i co jego obecność może oznaczać. Ale generalnie danych jest dużo.

Oczywiście to nie jedyne moje doświadczenia. Pracuję tez na komórkach, robię testy enzymatyczne dla wykrywania cytokiny i sprawdzam, czy w jej obecności same komórki nowotworu nie rosną szybciej lub wolniej. 

A to nie koniec. czeka nas jeszcze analiza mRNA w komórkach w guzie. Dopiero tam będzie natłok informacji! Ale tam działa bioinformatyka. 

I na koniec: tak, wiem. Cały dzień się bawię i jeszcze mi za to pacą. Uwielbiam swoją pracę!